電泳技術就是利用在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異,使帶電分子產生不同的遷移速度,從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。 電泳過程必須在一種支持介質中進行。Tiselius等在1937年進行的自由界面電泳沒有固定支持介質,所以擴散和對流都比較強,影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質的電泳,樣品在固定的介質中進行電泳過程,減少了擴散和對流等干擾作用。
制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子,在膠聚合后移去,形成上樣品的凹槽。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,或將凝膠直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變,進而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過程應在適當?shù)木彌_液中進行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質的穩(wěn)定。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質分子量.其原理是帶大量電荷的SDS結合到蛋白質分子上克服了蛋白質分子原有電荷的影響而得到恒定的荷/質比。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質分子量已經比較成功,此法測定時間短,分辨率高,所需樣品量極少(1~100μg),但只適用于球形或基本上呈球形的蛋白質,某些蛋白質不易與SDS結合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此時測定結果就不準確.
選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充分的分離。通常靠近前沿的蛋白帶分辨率不佳,所以應根據分子量與凝膠孔徑的關系,灌制足夠長度的凝膠,以使樣品不會走出前沿。樣品的蛋白水解作用也引起擴散而使分辨率降低。水解作用通常發(fā)生在樣品準備的時候,系統(tǒng)中的內源性蛋白酶會水解樣品蛋白,如果在緩沖液中加蛋白酶抑制劑可以減少這種情況的發(fā)生。
